多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品,还能够同时对比多个扩增子。
当一个PCR管中有多个引物对时,如在多重PCR中,因无法仅针对一个引物对或目的片段进行反应优化,而是要考虑到所有引物和靶标,所以可能会出现非特异性扩增和效率降低。因此,为尽量减少由非特异性扩增导至的错配,应对引物进行精心设计。
首先,引物序列应尽可能与其目的序列一一对应,并且所有引物的 Tm相差不应超过5°C。在多重PCR开始前,应利用单个PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。
此外,扩增子应具有不同的大小,从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。除了引物设计和扩增子大小,使用热启动DNA聚合酶和专为多重PCR设计的缓冲液也将有助于获得成功的PCR结果和提高反应特异性。
尽管多重PCR常作为终点法PCR,但由于其在多重标记和检测中的能力 ,将其用于实时荧光定量PCR也变得越来越流行。另外,多重实时荧光定量PCR也常被用于遗传标志物的检测,用于人类身份鉴定。