高GC含量PCR策略是指具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导至DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。

亲水性薄膜

为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。然而，这些试剂通常会降低引物的 Tm，所以退火温度也需进行相应的调整。

高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。

如果基因的5’端含有丰富的GC碱基，设计的PCR引物Tm值很高，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动（hot start）和降落-PCR，能取得了较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶，并延长起始变性时间如95℃变性15 min，能使模板DNA完全变性，以便提供最大数量的引物配对位点，可避免引物二聚体和非特异性配对。

PCR反应过程中，首先在高于引物Tm值的72℃左右扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。

尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，降落-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。

为你设置循环条件为：①95℃变性15 min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火温度每循环降低2.0℃，72℃ 45s，5个循环；③94℃ 45s，设置退火温度梯度从55℃到65℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；④72℃延伸10min。